质粒提取是分子生物学中一个基本而简单的实验。你不 不需要使用你的大脑，只需按照提取工具包中的说明来解释这个傻瓜 s操作（事实上，这些简单但耗时的实验应该由实验室里的机器人来操作）虽然操作简单，但是质粒提取也是重要的一步质粒提取的质量和数量将直接决定后续实验室的成败。当我们按照套件中的说明操作时，我们会看到不同的解决方案，如P1P2N3PE和EB（不同的试剂盒可能有不同的标签）那么你知道每瓶溶液里是什么吗？它们在质粒提取中的作用是什么？

通过碱裂解提取质粒（Alkali decomposition）所以让我们 让我们看看P1P2N3PE和EB的解决方案是什么。

溶液1（P1）

成分浓度25mMTris-HCl（pH8.50mM葡萄糖，50mM葡萄糖（Glucose）

溶液1的主要功能是悬浮细菌沉淀。25 million tons-HCl是一种缓冲溶液，用于确保反应系统的恒定pH值。EDTA是金属离子的螯合剂，10mMEDTA的作用是与微生物中的金属离子结合，抑制DNA酶的活性。50mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保证细菌的悬浮，延缓细菌的沉降时间。Rnase通常在使用前加入溶液1中（RNaseA）核糖核酸酶的作用非常明确，降解溶液中的RNA。由于核糖核酸酶属于蛋白质，蛋白质的稳定性很差，所以加入核糖核酸酶的溶液1需要在4℃的低温下保存。

溶液2（P2）

成分浓度250mMNaOH，1％W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）

溶液2的主要功能是细胞溶解。溶液1悬浮细胞后，需要加入溶液2，其作用是溶解细胞。解决方案2仅包括两个组件：氢氧化钠和十二烷基硫酸钠。真正在细胞裂解中起作用的是氢氧化钠，这也是为什么这种方法叫碱裂解。氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，使其双层化（双层膜）结构取向，胶束（微囊）结构的相变，导致细胞溶解。SDS的作用将在下一步提到。加入溶液2后需要注意的一点是时间一定不能太长，二是离心管不能剧烈晃动。时间过长和剧烈振动会使氢氧化钠破坏基因组DNA，破碎的基因组DNA片段会和大小相近的质粒一起被提取出来，污染样品。

溶液3（N3）

成分浓度3M醋酸钾（potassium acetate），5M醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步中加入的强碱，去除细胞中的蛋白质等杂质。Common is the abbreviation of neutralization。碱性溶液中的氢氧化钠会长期破坏其与DNA基础的结构，所以需要中和。要中和氢氧化钠，5M醋酸就够了，为什么还要加醋酸钾？做过质粒提取实验的同学应该记得，加入溶液N3后，会出现大量沉淀。这些沉淀实际上是溶液2中醋酸钾与SDS相互作用产生的十二烷基硫酸钾（英文名称十二烷基硫酸钾，PDS）加入溶液N3后，SDS遇到钾离子，PDS不溶于水，会很快沉淀。

那么溶液3的加入是如何去除蛋白质基因组DNA等杂质的呢？原因是溶液2中加入的十二烷基硫酸钠(SDS)容易与蛋白质结合，平均两个氨基酸会与一个SDS分子结合，它们的结合会形成SDS2多肽复合物，使变性的蛋白质溶解在溶液中，从而使多肽链更好地与基因组DNA纠缠在一起。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸酯与变性蛋白结合成复合物，十二烷基硫酸酯的沉淀会将变性蛋白一起沉淀，同时变性蛋白会与基因组DNA纠缠在一起，大部分结果是共沉淀。高离子浓度的溶液加速沉淀过程。此外，溶液中和后变性蛋白表面电荷减少，也能促进变性蛋白的沉淀。

溶液PE（laundry bag）

成分浓度10mMTris-HCl（pH7.5），80%乙醇（Ethanol）

洗面奶的作用主要是洗去多余的盐离子。所有的试剂盒都使用硅胶柱提取DNA。DNA吸附在硅胶柱上后，需要用洗脸盆洗去多余的盐离子。洗衣袋含有高浓度的乙醇因为乙醇会影响后续的消化或测序反应，所以在洗脱DNA之前必须在离心机中”空甩”柱，完全除去乙醇。

溶液EB（Elution buffer）

成分浓度10mMTris-HCl（pH7.5）

EB的作用是洗脱硅胶柱上的DNA样品。洗脱缓冲液中不能含有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离子会破坏硅胶负氧自由基与水的氢键，使整个硅胶带正电荷，吸引带负电荷的DNA分子。此外，加热的洗脱液（50°C）可以加速DNA从硅胶膜上的分离。另外，离心前在膜上长时间保留EB缓冲液会更有利于DNA洗脱。

不同公司的质粒提取试剂盒中的溶液成分可能不一样，比如P1可以去除葡萄糖，PE溶液甚至可以直接用水代替。质粒提取实验是分子生物学中一个基本而重要的实验虽然这个实验本身很简单，但它的原理有些复杂。边肖认为，知道它是什么和为什么，知道实验的原理，当实验中出现问题时，就会更容易找到原因并加以纠正。